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當前位置:首頁新聞中心Matrigel 使用指南及常見疑問

Matrigel 使用指南及常見疑問

更新時間:2017-09-08點擊次數(shù):13226

Matrigel 收貨注意事項,請檢查:

1.       盒子內是否有干冰

2.       基質膠是否呈固態(tài),膠面是否水平

3.       基質膠顏色是否在正常范圍(黃色-粉紅-深紅)

產品特性 :

Martrigel基質會有色差變化(淡黃色到深紅色),是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2的作用引起的,但是與5%CO2平衡后色差即會減少。

基質膠凍融操作

收貨后,若不立刻使用基質膠,應馬上將仍然是冷凍固態(tài)的基質膠放進-20冰箱保存。使用前須先將基質膠凍融。

凍融:

將基質膠埋于鋪滿碎冰的冰盒中,然后將整冰盒放入4冰箱過夜溶解。(普通濃度的基質膠,溶解時間1-2天;高濃度基質膠溶解時間 3-7天)。

分裝:

溶解后的須分裝保存,以避免反復凍融。液態(tài)基質膠,會在10以上快速成膠(特別是高濃度基質膠),因此,分裝時,接觸到基質膠的耗材必須預冷(如移液管、吸頭、EP管等),并且整個實驗必須無菌、冰上操作。(高濃度的基質膠比較粘稠,用移液器不好吸取,可以使用去掉針頭的預冷注射器吸取。)

 

保存:

分裝后的基質膠在冰上應仍然呈現(xiàn)液態(tài),此時將基質膠放進-20保存即可。進行實驗時,取出分裝好的小管,4凍融。若分裝好后基質膠已經凝固,說明分裝操作不能很好地保持低溫,導致基質膠已經成膠,不適宜使用。

普通濃度基質膠操作

包被與成膠

細胞可在0.5mm厚度的基質膠表面生長,可以在1mm厚度的三維基質內生長。過度稀釋的基質膠會形成非膠質的蛋白層,可以用于細胞貼壁,但不能用于細胞的研究分化。為保證基質膠的成膠性能與穩(wěn)定,稀釋濃度不應低于13,可用預冷無血清培養(yǎng)基稀釋,成膠后立即使用。

薄膠成膠方法:

1.      凍融后,用預冷的移液槍頭混勻基質膠成勻漿狀。

2.  將需要使用的培養(yǎng)板置于冰上,加入濃度為50ul/cm2生長面積的基質膠。

3.  37放置30min,即可使用。

厚膠成膠方法

1.      凍融后,用預冷的移液槍頭混勻基質膠成勻漿狀。

2.      將需要使用的培養(yǎng)板置于冰上,將培養(yǎng)的細胞與基質膠混合,用移液槍頭使其懸浮于基質中。加入濃度為150-200 ul/cm2生長面積的基質膠。

37放置30min,可成膠。也可以加入細胞培養(yǎng)的基質,也可使細胞直接生長在膠表面。

薄層包被方法:

1.  凍融后,用預冷的移液槍頭混勻基質膠成勻漿狀。

2.  根據(jù)需要,采用無血清培養(yǎng)基稀釋基質膠,根據(jù)實驗需要確定*包被濃度。

3.  將稀釋的基質膠包被與所需的培養(yǎng)器皿中,包被量至少覆蓋整個器皿的生長表面,室溫下孵育1小時。

去除未結合的基質膠,用無血清培養(yǎng)基輕輕地沖洗。備注:普通濃度的基質膠,建議稀釋濃度不低于3mg/ml;我們不能保證稀釋濃度低于3mg/ml能夠成膠。

普通濃度的基質膠,不建議用于成瘤實驗。

BD細胞回收劑354253,離散酶354235,冰浴7小時后回收得到細胞。

腫瘤侵襲實驗:

操作過程

1.     凍融(對于預包被的24孔培養(yǎng)小室請參考1.1-1.3操作,對于自己包被好待用的24孔小室,請直接從步驟2開始)

1.1       -20冰箱中取出產品,使其自然升溫到室溫。

1.2       取出培養(yǎng)板在細胞小室內加入500μL 37預熱的PBS,37CO2環(huán)境下孵育2小時。

1.3       解凍后,小心去除小室內的培養(yǎng)基,避免破壞Matrigel基質膜。

 

2. 染色劑后標記法

細胞通過侵襲消化基質膜后遷移到下小室,采用熒光標記定量細胞。細胞的侵襲能力用終點計算法計算得到。對于采用實時動力曲線的計算,推薦使用前標記法。

2.1 如步驟1 準備培養(yǎng)板。

2.2 胰酶消化細胞單層后制得細胞懸液,溶于無血清DMEM培養(yǎng)基,推薦濃度為5×104cells/mL。

2.3 上小室中加入500μL細胞懸液(2×104 cells)。

2.4 通過進樣口在下小室中加入750μL誘導劑。

2.5 37,5% CO2 條件下孵育培養(yǎng)板和對照板20-22小時(由細胞類型決定)。

2.6 孵育后,小心去除上小室中的培養(yǎng)基及基質膠,避免破壞小室的膜及膜底侵襲轉移的細胞。

2.7 將培養(yǎng)小室轉移到另一塊24孔板中,結晶紫或鈣黃綠素染色。計算。

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